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中科项目文章|IF=15, 蛋白组揭示神经毒性保护的重要分子靶点

2019-09-09

关键词:褪黑素、神经炎症、定量蛋白质组学分析、serpina3n、三甲基氯化锡


01

研究背景
三甲基氯化锡(TMT)是有机锡化合物的代表,通常用作聚氯乙烯(PVC)稳定剂,是一种毒性很高的神经毒剂,可以引起神经炎症和神经细胞死亡。在实际生产应用中,TMT中毒多与有机锡用做塑料稳定剂有关,从事有机锡塑料稳定剂研究、生产、使用等工作都有可能导致TMT中毒。
一旦中毒,TMT可导致中毒者产生精神错乱、记忆缺陷和癫痫症状。尽管引起了许多悲剧,但TMT诱导的神经毒性的分子机制尚未得到充分研究,也没有预防或治疗策略。
近期,浙江大学医学院、美国UT Health San Antonio医学中心、第四军医大学以及陆军军医大学的研究团队合作研究了褪黑素对TMT诱导的神经毒性的保护作用及其潜在机制,并通过定量蛋白质组和生物信息学分析了发现了褪黑素对TMT诱导的神经毒性保护作用的重要分子靶点。
该研究成果于近期发表在《Journal of Pineal Research》上,而中科新生命十分荣幸地参与了蛋白组学的分析工作。


Inhibition of SERPINA3N‐dependent neuroinflammation is essential for melatonin to ameliorate trimethyltin chloride–induced neurotoxicity


IF=15.221


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02

材料准备
作者以C57BL/6J雄鼠为对象,设置了四个组别:对照组、褪黑素处理组(MEL)、TMT处理组(TMT)组以及接受褪黑素治疗的TMT处理组(TMT+MEL)组。

03

技术路线


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04

探索攻略
1.  表型分析确认处理有效性
研究团队通过表型分析来确认TMT的中毒表型,以及褪黑素处理是否有效。在这部分工作中,表型的确认可以分为两个方面:
1.1 行为学差异
研究人员对于各个组别的小鼠分别进行了癫痫评分、被动回避实验、新奇物识别实验以及旷场实验,来比较各个组别小鼠在行为学上的差异。结果显示,褪黑素治疗显著减弱了小鼠癫痫的临床症状,同时可防止由TMT引起的神经炎症导致的行为改变。


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褪黑素可以减轻TMT诱导的异常神经行为
1.2 病理学差异
研究人员接下来检查了海马的组织病理学变化。结果显示,TMT组小鼠海马神经元显著丢失,而褪黑素处理明显减弱了海马神经元的损伤。


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褪黑素可减轻TMT诱导的海马神经元损伤

2.分子层面找关键差异
2.1 系统差异分析-定量蛋白组学
为了确定褪黑素治疗如何保护海马体免受TMT神经毒性的影响,在TMT处理后第4天分别收集了三个处理组的小鼠海马体(对照组、TMT组和TMT+mel组),并进行定量蛋白质组学分析,以寻找不同处理的蛋白组表达水平差异。
与对照组相比,TMT组有61种差异表达蛋白质,其中,39种蛋白的表达水平上调,22种蛋白下调。与TMT组相比,TMT+mel组有17种小鼠海马蛋白显著下调。将两次比较获得的差异蛋白进行维恩分析发现,经TMT处理后显著上调的6种蛋白被褪黑素处理显著抑制。


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定量蛋白组学分析比较各组处理的差异表达蛋白
2.2 差异之中找关键--关键蛋白的筛选与数据验证
与对照组相比,TMT组SERPINA3N表达差异最大,显著增加了2.78倍。然而,褪黑素治疗显著抑制了TMT组小鼠海马中SERPINA3N的表达。为了验证组学结果,研究人员用qPCR和Western blot分别测定了不同组海马中的SERPINA3N在mRNA和蛋白质水平的表达,其结果与蛋白质组学分析一致。上述结果表明,褪黑素抑制TMT诱导的SERPINA3N表达。


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褪黑素抑制TMT诱导的SERPINA3N表达
3.生理层面讨论褪黑素功能


免疫荧光分析显示,TMT处理显著提高了小鼠海马DG和CA3亚区的gfap表达,表明TMT诱导星形细胞活化并导致星形胶质细胞增生,其特征是伴随着海马活化的星形胶质细胞中SERPINA3N和GFAP的表达增加。值得注意的是,褪黑素治疗同时抑制了TMT处理小鼠海马中的GFAPSERPINA3N表达。


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免疫荧光分析蛋白表达差异


随后,研究人员测定了C3、Gbp2、Serping1、Ccl2和Cxcl10等毒害神经的星形细胞激活标志物的表达水平。结果显示,与对照组相比,TMT组小鼠C3、Gbp2、Ccl2和Cxcl10的mRNA表达水平增加了436%、516%、495%以及862%。而与对照组相比,TMT+MEL组的上调幅度显著低于TMT组。

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星形细胞激活标志物检测
由于已知活化的星形胶质细胞会产生参与神经炎症的有害促炎细胞因子,研究人员接下来测定了TMT治疗小鼠海马中促炎细胞因子的变化,并测试了褪黑激素治疗是否能提供保护。结果表明,在接受TMT处理的小鼠的海马中,TNFα、IL-6和IL-1β的mRNA和蛋白表达均呈上调趋势,而褪黑素治疗明显拮抗了TMT诱导的这些促炎细胞因子的上调。


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促炎细胞因子表达水平检测
上述结果说明,褪黑素可以抑制TMT诱导的星形细胞活化和促炎细胞因子的产生。
4.过表达动物模型深入验证SERPINA3N功能
为了进一步阐明褪黑素是否通过抑制SERPINA3N的表达来保护TMT的神经毒性,研究团队在小鼠模型中过表达SERPINA3N后发现,褪黑素的保护作用被消除。同时,过表达SERPINA3N可抵消褪黑激素对TMT诱导的星形细胞活化和神经炎症的影响。

05

研究小结
该研究基于定量蛋白质组和生物信息学分析以及体内AAV-Serpina3n转染,首次表明:
(a)褪黑素通过减弱海马神经元丢失、抑制癫痫样癫痫发作和改善记忆缺陷,显著减轻了TMT诱导的小鼠神经毒害。
(b)褪黑素显著抑制了TMT诱导的神经炎症反应和星形细胞活化,表现为炎性细胞因子产生的减少以及神经毒性反应性星形细胞表型标记物的下调。
(c)SERPINA3N不仅在TMT诱导的神经炎症和神经毒性中起着关键作用,同时也是褪黑激素的关键靶点,对TMT诱导的神经炎症和神经毒性有调节作用。
由此可见,褪黑素在临床实践中可能是一种有前途和实用的降低TMT诱导的神经毒性的药物。


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褪黑素通过抑制serpina3n依赖性神经炎症减轻了TMT诱导的神经毒性

06

小编心得
该研究利用蛋白组学分析大规模筛选,通过对比不同处理找到差异最大的蛋白,结合已报道的蛋白功能去筛选关键蛋白,随后又在数据层面、生理实验层面进行了多番验证,最终阐明了褪黑素减轻TMT神经毒害的机制,并获得了作用靶点,为后续的临床转化提供了坚实的基础。

07

中科蛋白组技术介绍
常规蛋白质组
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