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客户文献 | mSystems:定量乙酰化修饰组揭示病原菌致病机制

2019-06-18

大家好,在之前的修饰专栏《植物逆境研究中的翻译后修饰组最新报道》中,小编曾为大家总结过修饰在植物非生物胁迫、生物胁迫中的发挥的重要功能。本期,小编将带来一篇最新发表的客户文献,为大家阐述如何通过修饰组学探究病原菌的致病性。

该文章由华南农业大学研究团队于2018年11月发表在微生物学一区杂志《mSystems》上,该文章主要运用乙酰化修饰组结合验证的方法,发现了乙酰转移酶Gcn5可通过两个层次,即胞质中蛋白乙酰化调节以及胞核中组蛋白乙酰化调节共同介导病原菌致病性。此外,作者不仅对以往发现的稻瘟病菌效应子Gcn5修饰底物,即自噬蛋白ATG和组蛋白H3进行了验证讨论,而且Gcn5对新发现的修饰底物蛋白,即代谢酶Pk进行了深入研究,最终从多个层次多种角度探究了Gcn5调控的下游蛋白乙酰化修饰在病菌致病过程中的重要作用。其中,定量乙酰化修饰组的工作由中科新生命助力完成。

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文献小笔记

mSystems  IF=5.75

微生物学|JCR:I区

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是一类对全球食品安全构成巨大威胁真菌病原菌。对于稻瘟病菌研究发现,其在分生孢子(无性孢子形成)和附着物(感染结构)形成期间,该病菌能够诱导自噬从而引发糖原分解或程序化细胞死亡,而这两者对于稻瘟病菌致病性都是必需的。以往,研究团队在稻瘟病菌中鉴定了一个诱导的自噬和分生孢子的关键酶Gcn5,其是一个组蛋白乙酰转移酶(HAT)。为了进一步研究Gcn5在稻瘟病菌致病过程中的重要性,研究人员利用定量乙酰化修饰组,筛选Gcn5的重要底物,以期揭示GCN5在病菌致病过程中发挥的重要功能。

实验材料

稻瘟病菌野生型(WT)、GCN5过表达(OX)、GCN5过表达OX修饰位点突变体、GCN5缺失(KO)突变体在28℃固体培养基中培养6天,后暴露于光照下12小时。随后进行组学实验和验证实验等。

实验结果

1、利用乙酰化修饰组鉴定乙酰化修饰蛋白,筛选GCN5潜在的乙酰化修饰底物。

在乙酰化修饰组定量实验中,作者在稻瘟病菌的野生型和GCN5过表达株中一共鉴定了1551个乙酰化修饰位点,704个乙酰化修饰蛋白。进一步通过定量比较,作者保留了两种菌株种修饰变化超过2倍的蛋白,最终筛选了92个差异乙酰化修饰位点, 82个修饰差异蛋白质,而这些差异的修饰蛋白在代谢通路和信号转导通路中发生显著富集,生物信息学分析如下(图1)。

图1

图1. 乙酰化组鉴定的修饰肽段和蛋白以及功能分析

2、GCN5通过组蛋白和非组蛋白的乙酰化调解稻瘟病菌的自噬反应。

获得了差异的乙酰化修饰底物后,进一步则是对于底物蛋白的筛选与验证。而在这边文章中,作者给我展示了一个值得借鉴的方法,先挑选已经实验探究过的修饰蛋白进行讨论。其中,我们不仅可以对蛋白已验证功能的位点进行讨论,突出本次实验和以往研究的一致性,而且可以讨论蛋白中未被鉴定过的新位点。在本研究中,作者首先挑选以往研究发现的乙酰化修饰蛋白,即自噬蛋白Atg7和组蛋白H3进行讨论,他发现Atg7的K338以及H3 K79的乙酰化修饰在比较组中发生变化。随后,作者利用遗传学方法分别构建乙酰化位点单突变株(H3M)和乙酰化位点双突变株(Atg7M H3M)。研究发现(图2. & 图3.),GCN5通过组蛋白和非组蛋白的乙酰化两个层次调解稻瘟病菌的自噬反应。


图2&图3

图2. & 图3.GCN5通过组蛋白和非组蛋白的乙酰化条件稻瘟病菌的自噬反应

3、GCN5通过乙酰化修饰丙酮酸激酶的稳定性。

在研究的第二阶段,作者又挑选了GCN5的新修饰底物进行验证和机制研究。由于丙酮酸激酶(Pk)是调控糖酵解中的关键酶,而糖酵解在病菌致病过程中发会重要作用,故作者选择了Pk进行验证和功能研究。研究发现,GCN5与Pk相互作用并且其能够通过K188乙酰化修饰(M2)调节Pk的稳定性,而Pk K188乙酰化可能诱导了其发生自噬依赖的降解(图4. & 图5.)。


图4&图5

图4. & 图5. Gcn5与Pk相互作用且通过PK上K188乙酰化影响其稳定性。

4、丙酮酸激酶在稻瘟病菌致病性中发挥重要作用。

验证了Pk是GCN5的乙酰化修饰底物后,作者进一步就是验证其确实具有重要的生物学意义。利用过表达野生型和修饰位点突变型PK的菌株,作者研究了Pk乙酰化对稻瘟病菌分生孢子(无性孢子产生)以及感染力的影响。结果发现,Pk蛋白乙酰化促进稻瘟病菌分生孢子,并且介导了病菌致病性(图6.)。


图6

图6.Pk蛋白乙酰化促进稻瘟病菌分生孢子在病菌致病过程中发生重要作用

5、Gcn5 调控基因表达

最后,鉴于Gcn5还可以从基因表达层次上调节病菌致病性,作者进行了转录组的分析,发现其对于氧化应激、能量代谢等诸多过程中的基因表达起调控作用。

实验结论

研究结果表明,Gcn5可以从组蛋白乙酰化介导的基因表达以及胞质蛋白乙酰化介导的自噬调节、代谢调控等过程,通过多方面的调控在稻瘟病菌致病过程中发挥重要作用(图.7)。


图7

图7.乙酰化修饰通过多种途径的调控在病菌致病过程中发挥潜在重要作用


小编总结

在本文中,作者从一个已经鉴定的重要病菌效应子--乙酰转移酶Gcn5出发,通过乙酰化修饰组的研究寻找该酶的修饰底物,通过有效的筛选和验证,最终为我们呈现了Gcn5下游修饰蛋白的不同调节机制,是一篇值得借鉴的寻找酶下游底物蛋白并进行机制探究的文章。

首先,在对乙酰化修饰组数据分析中,作者先将本研究中已知蛋白上的修饰变化与以往报道文章中的修饰变化进行比较,突出了变化趋势一致性,也侧面体现出本研究的可靠性。随后,作者对已知自噬蛋白ATG和组蛋白H3上的修饰变化位点进行突变,重点研究它们的修饰变化在自噬过程中的作用,结果发现,ATG和H3乙酰化修饰共同介导自噬。考虑到Gcn5对于组蛋白的修饰调节能调控基因表达,结合转录组的分析,作者证明了Gcn5在表观遗传学调节作为组蛋白修饰因子在营养信号、能量稳态关键代谢及应激反应途径中执行广泛调节。

其次,作者继续深入挖掘乙酰化修饰组的数据,尤其是重点关注修饰蛋白中未知的修饰差异,增加文章的创新性。由于糖酵解是介导病菌致病性的重要生物学过程,于是作者结合修饰差异变化和生物背景,对糖酵解中的关键酶-丙酮酸激酶Pk进行了更为深入的研究。利用免疫共沉淀,作者不仅验证了乙酰转移酶Gcn5与底物Pk的相互作用,并且证实了底物Pk上的K188乙酰化修饰位点能够促进酶与底物的结合并影响了Pk的稳定性。随后,作者进一步利用过表达修饰突变体的病菌进行功能实验,最终证实了Pk蛋白的乙酰化在促进分生孢子、介导病菌致病性过程中发挥重要作用。

因此,该文很好的为我们呈现了Gcn5通过乙酰化修饰,从间接和直接的层面,调控病菌自噬、糖酵解或其他代谢等过程,介导病菌致病。

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